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乳酸菌（lactic acid bacteria）：一類通過發(fā)酵糖類產生乳酸的細菌，因其能夠將碳水化合物發(fā)酵成乳酸而得名。常見的乳酸菌屬有乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬等。
（圖片源自網絡）
乳酸菌：
身份多變的“全能大師”
??食品界的“明星”：酸奶、乳酪、泡菜、酸菜，這些美味的食品都有乳酸菌的身影，它們用發(fā)酵的魔法提升了食品的味道和營養(yǎng)價值。乳酸菌不僅讓食物更美味，還常用于乳制品的質量認證和新產品的開發(fā)。
??生物醫(yī)藥界的“配送員”：乳酸菌作為藥物傳遞載體，既安全又高效，適用于口服、鼻飼和陰道給藥等方式，廣泛應用于治療黏膜感染、炎癥性腸病、腫瘤及疫苗研發(fā)等領域。它們不僅能為我們傳遞治療藥物，還能生產胰島素、疫苗等生物藥物。
??健康領域的“偵探長”：乳酸菌在腸道健康方面的表現可謂“功勛卓著”。通過檢測腸道菌株的豐度和分布，可以評估乳酸菌攝入對腸道微生物群落的影響。將腸道微生物組學與蛋白組學相結合，可以更深入地探索它與各種疾病之間的關聯。
??畜牧農業(yè)中的“衛(wèi)士”：乳酸菌發(fā)酵可用于制作畜牧養(yǎng)殖的優(yōu)秀飼料，也可通過檢測乳酸菌種類來優(yōu)化肥料配方。此外，通過檢測土壤中乳酸菌的存活率和定植能力還可以用于評估生物肥料對農作物的有效性。
??環(huán)境領域的“清潔工”：乳酸菌在污水處理、生態(tài)修復方面也有著出色的表現，它們通過調節(jié)水體和土壤中的生態(tài)環(huán)境，幫助修復被污染的生態(tài)系統(tǒng)。也可通過水體或土壤中乳酸菌種類及其濃度來評估環(huán)境生態(tài)的變化。
??化妝品界的“研發(fā)師”：乳酸菌發(fā)酵物在化妝品中有保濕、抗炎、修復等多種功能，通過監(jiān)測其活性可評估化妝品功效并優(yōu)化配方。
流式細胞儀：
乳酸菌研究中的“超能利器”
通過特定的熒光染料對乳酸菌進行染色，使用流式細胞儀能夠區(qū)分活菌與死菌，并進行計數。這種方法快速、準確，避免了傳統(tǒng)平板計數法可能存在的低估細菌數量、無法檢測不形成菌落的細菌等問題。
乳酸菌飲料及發(fā)酵食物的質量控制：
通過檢測產品中乳酸菌的數量，可以評估產品的品質，判斷保質期，確認是否有雜菌污染。
乳酸菌自溶檢測：
乳酸菌自溶會釋放出胞內物質，這可能會影響發(fā)酵產品的品質，如產生異味、改變質地等。流式細胞儀可以通過檢測細胞完整性等指標來判斷乳酸菌是否發(fā)生自溶，為控制發(fā)酵過程和產品質量提供依據。
乳酸菌的篩選與鑒定：
結合不同的熒光標記技術和檢測參數，可以對乳酸菌進行更準確的鑒定，區(qū)分不同種類或菌株的乳酸菌，這對于研究乳酸菌的多樣性和功能特性具有重要意義。
研究乳酸菌與其他微生物的相互作用：
對乳酸菌和其他微生物進行標記和檢測，從而研究它們之間的相互作用關系。例如，在混合發(fā)酵體系中，乳酸菌與酵母菌可能存在共生或競爭關系，流式細胞儀能夠通過分析它們的數量、活力以及相互之間的接觸情況等，深入探究這種相互作用的機制。
流式細胞儀用于乳酸菌死活計數是其目前最為廣泛的用途之一，有關這部分的詳細情報，讓我們一起來看看吧。
傳統(tǒng)上，平板培養(yǎng)法計數一直是乳酸菌死活計數的經典且廣泛應用的方法。然而，近年來，流式細胞儀正逐步取代平板培養(yǎng)法成為新的首選方法，這得益于其多方面的優(yōu)勢：
· 高靈敏度：確保了計數的精準性
· 高效省時：短耗時提升了實驗效率
· 穩(wěn)定可靠：結果的高度穩(wěn)定性與良好的重復性保障了數據的可靠性
· 多維分析：可有效區(qū)分活性細胞與總細胞，進一步豐富了分析維度
· 高通量：高通量分析能力極大地促進了大規(guī)模樣本的快速處理
圖1：流式細胞儀和平板培養(yǎng)法在乳酸菌死活計數工作中整體對比
圖2：流式細胞儀和平板培養(yǎng)法在乳酸菌死活計數工作流程的對比
圖3(左)：流式細胞儀和平板計數準確性比較
圖4(右)：流式細胞儀和平板計數相關性
圖3和圖4引自《流式細胞術檢測水中細菌總數的方法研究》,DOI：10.19965/j.cnki.iwt.2021-0892。
方法1：CFPA+PI染色法
??實驗原理：CFDA是一種非熒光性的化合物，具有細胞膜通透性。進入細胞后，它被細胞內的酯酶水解成具綠色熒光性的產物。這種熒光性產物生成僅限于代謝活性正常的細胞，且因不易穿透活細胞膜被限制在細胞內，結合使用PI（不能穿透活細胞膜但可以穿透死細胞膜），利用兩者對細胞膜完整性差異所導致的通透性不同，我們可以使用流式的FITC通道有效地鑒別活細胞與死細胞。
??實驗流程：
圖5：cFDA PI染色法操作流程圖
??實驗結果：
圖6：流式細胞分析圖譜中活性和非活性細菌區(qū)分
雙歧桿菌菌液培養(yǎng)物暴露于0%、0.05%、0.1%、0.2%或0.25%膽汁鹽，同時用cFDA和PI染色。細胞分為4群：cFDA+PI-為活細菌，cFDA+PI+為受損的細菌，cFDA-PI+為死細菌，cFDA-PI-為雜質或碎片。
方法2：SYTO+PI染色法
??實驗原理：SYTO是一種核酸染料，具有胞膜通透性，可以穿過活細胞和死細胞膜，并與細胞內DNA結合，發(fā)出綠色熒光，可用用FITC通道檢測。而PI只能通過受損或死細胞的膜。當胞膜受損時候，SYTO和PI同時進入細胞膜內，并展開對DNA的競爭性地結合，這一過程會削弱原本由SYTO產生的綠色熒光信號強度。因此，具有完整細胞膜的活細胞呈現綠色，而細胞膜受損的細胞則呈現紅色。通過觀察熒光信號的顏色變化，我們可以對細胞的活性狀態(tài)做出判斷。
??實驗流程：
圖7：SYTO PI染色法操作流程圖
??實驗結果：
A:
B:
圖8：利用Syto9和PI染料檢測細菌死活
（使用儀器——層浪Fongcyte流式細胞儀）
A：排除背景噪音/雜質，圈出 FSC和SSC較大的群落，為細菌主群；B：SYTO和PI雙染，綠色熒光區(qū)域為細胞膜結構完整的顆粒即活菌，而紅色熒光區(qū)域為細胞膜結構受損的細菌即死菌，右上角的細菌為過渡狀態(tài)的細菌（健康活細菌到死細菌的過渡階段）。
活菌熒光單位計算公式：
AFU=N1×a×1000(AFU/mL(g))
AFU：活性熒光單位
N1：儀器統(tǒng)計活菌濃度(cells/ul)
a：樣品稀釋倍數
1000：是ul和ml間單位換算系數
報告結果說明：采用流式細胞術對死活菌進行計數，其結果以AFU/mL(g)為單位進行報告。流式方法得到結果與經典平板培養(yǎng)法測得的菌落形成單位CFU/mL(g)結果之間具有顯著的相關性。
??????? 細菌直徑比較小，建議FS和SS選擇對數放大模式。為減少雜信號的影響，可以通過FSC-A和FSC-H排除粘連體。
??????? 流式細胞儀檢測乳酸菌的濃度時，需要將樣本濃度控制在1x106-107個/ml左右，確保流式檢測結果準確。
??????? 如遇細菌與背景噪音較難區(qū)分情況，可先通過核酸染料如SYTO圈出陽性群體并設門。通過反射門方式在FSC和SSC圖中圈出主細菌群體。
??????? 由于PI的發(fā)射光譜較寬，最佳發(fā)射光617nm。流式檢測時，可選擇PE、ECD(620/30)或PerCP通道。建議首先ECD(620/30)或Percp通道，即可保障最佳的接收光，也可減少FITC通道信號溢漏，減少補償調節(jié)。
??????? 除了乳酸菌之外，流式細胞儀還可以被應用于分析其他多種菌種的相關指標，包括大腸桿菌、趨磁細菌、化膿性鏈球菌、球芽孢桿菌以及草生歐文氏菌等。利用流式細胞儀，可分析細菌濃度、評估細菌活力、鑒別種屬，并進一步探究細菌群體分化情況等。
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